Современные достижения клонирования животных

СОВРЕМЕННЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ КЛОНИРОВАНИЯ ЖИВОТНЫХК.С.Кршшвская, А.А.Колонцов

Московский государственный областной гуманитарный институт, г.Орехово-Зуево

История клонирования началась около 4 тысяч лет назад, когда стало возмож­ным размножать растения с помощью отростков, черенков и клубней. В этом случае дочернее растение получало все гены растения-родителя в неизмененном виде. Одна­ко термин "клонирование" появился относительно недавно, после того как в 1963 го­ду британский генетик Дж.С. Холдейн ввел в употребление слово "клон" (от грече­ского "ветвь" или "отпрыск"). Клонирование - это точное воспроизведение генной структуры того или иного живого объекта в некотором количестве копий.

Для бактерий и одноклеточных растений и животных клонирование является, как правило, обычным способом размножения. При прямом делении клеток, или ми­тозе, все гены без изменений переходят от предков к потомкам, если не считать слу­чайных мутаций. Поскольку при половом размножении дочерний организм получает половину генов от отца, а половину от матери, для получения генетически идентич­ных организмов нужны специальные подходы.

Первые клоны животных были созданы еще на рубеже 19-го и 20-го столетий в опытах с морскими ежами. В основу экспериментов была положена способность ис­кусственно разделённых клеток зародыша на стадии раннего дробления развиваться в целый организм. В дальнейшем для получения клонов использовали метод ядерного трансфера, то есть переноса ядер. Р.У. Бриггс и Т. Кинг в 1952 году, пользуясь мик­ропипеткой, удаляли ядра из яйцеклеток шпорцевой лягушки, а вместо них переса­живали ядра клеток эмбрионов, находящихся на разных стадиях развития. Ядра ран­них эмбрионов в стадии поздней бластулы и даже ранней гаструлы обладают тотипо-тентностыо и обеспечивают нормальное развитие эмбрионов. Доля переносов, при водивших к. благополучному развитию зародыша Фпревращению в нормального го­ловастика, зависела от эмбриональной стадии, на которой отбирали клетки-доноры. Если донорами служили клетки бластулы, то успешными оказывались 80% перено­сов, Клетки на стадии гаструлы в 20% случаев давали положительный результат. При пересадке ядер из более дифференцированных клеток (мезодермы и средней кишки) поздней гаструлы у эмбрионов наблюдалось недоразвитие и даже отсутствие нервной системы. После пересадки ядра из клеток более позднего развития яйцеклетки вооб­ще не развивались.

В 1985 году в СССР была описана технология клонирования костных рыб, раз­работанная Л.А. Слепцовой, Н.В. Дабагян и К.Г.Газарян. Зародыши на стадии бласту­лы отделяли от желтка. Ядра клеток зародышей впрыскивали в цитоплазму неоплодо-творенных икринок, которые начинали дробиться и развивались в личинки.

В 1981-1983 годах были получены первые клоны млекопитающих. В качестве донора использовали эмбриональные клетки одной из линий мышей, взятые на ста­дии бластоцисты не позднее 2 бластомеров (Дж. Мак Грат и Д. Солтер), С. Стик и Дж. Робл, используя методику МакГрата и Солтера, в 1988 г. получили 6 живых кроликов, пересадив ядра 8 клеточных эмбрионов одной породы в лишенные ядра яйцеклетки кроликов другой породы. Фенотип родившегося потомства полностью соответствовал фенотипу донора. В этих экспериментах только 6 из 164 реконструированных яйце­клеток (3,7%) развились в нормальных животных.

Первые успешные эксперименты по клонированию сельскохозяйственных жи­вотных были проведены С. Уилладсином в 1986 г. Он сливал безъядерные яйцеклетки с бластомерами, выделенными из 8 и 16-клеточного эмбриона овцы. Тот же автор в 1989 году сообщил, что ему удалось получить четырех генетически идентичных быч­ков холстейнской породы в результате пересадки в реципиентные яйцеклетки ядер бластомеров одного 32-клеточного зародыша. К. Бондиоли и соавторы (1990), ис­пользуя в качестве доноров ядер 16-64-клеточные зародыши коров, трансплантирова­ли 463 реконструированных зародыша в матку синхронизированных реципиентов, и было получено 92 живых теленка. Семь из них были генетически идентичны, пред­ставляя собой клон, полученный в результате пересадки ядер клеток одного донор­ского эмбриона. Успешные исследования по клонированию свиней провели Р. Пратер с соавторами в 1989 году.

Следующим достижением в клонировании млекопитающих явилось использо­вание в качестве доноров ядер клеточной культуры. В 1993-1995 годах группа исследо­вателей под руководством Я. Вилмута из Рослинского института получила клон овец - 5 идентичных животных, донорами ядер которых была культура эмбриональных клеток. Клеточную культуру получали микрохирургическим выделением эмбрио­нального диска из 9-дневного овечьего эмбриона (бластоцисты) с последующим культивированием клетокinvitro. Сначала клеточная культура напоминала культуру стволовых недифференцированных эмбриональных клеток, по вскоре, после 2-3-х пассажей, клетки становились уплотненными и морфологически сходными с эпите­лиальными. Эта линия клеток из 9-дневного зародыша овцы была обозначена как TNT4.

Чтобы донорское ядро и реципиентная цитоплазма находились на сходных ста­диях клеточного цикла, останавливали деление культивируемых клеток TNT4 на оп­ределенной стадии (GO) и ядра этих клеток пересаживали в энуклеированные яйце­клетки (соответственно на стадии метафазы II). Реконструированные эмбрионы за­ключали в агар и трансплантировали в перевязанные яйцеводы овец. Через 6 дней эм­брионы вымывали из яйцевода первого реципиента и исследовали под микроскопом. Отбирали те, которые достигли стадии морулы или бластоцисты, и пересаживали их в матку овцы - окончательного реципиента, где развитие продолжалось до рождения. Родилось 5 ягнят (самок), из них 2 погибли вскоре после рождения, 3-й в возрасте 10 дней, а 2 оставшихся - Меган и Морган - нормально развивались и достигли 8-9-месячного возраста. Фенотипически все ягнята были сходны с породой овец, от кото­рой получали исходную линию клеток TNT4. Это подтвердил и генетический анализ.

В начале 1997 года Я.Вилмут с соавторами сообщили, что в результате исполь­зования донорского ядра клетки молочной железы овцы, то есть ядра дифференциро­ванной соматической клетки, было получено клональное животное - знаменитая овца по кличке Долли. Ооциты извлекли из овец породы Шотландская черномордая, по­местили в искусственную питательную среду с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки при температуре 37 градусов и провели операцию энуклеации (удаление собственного ядра). В качестве донора ядра использовали диплоидные клетки молоч­ной железы взрослой беременной овцы породы Финский дорсет. Эти клетки выводили из стадии роста клеточного цикла, разбавляя сыворотку, и через пять дней сливали с энуклеированным ооцитом. Реконструированный ооцит активировали с помощью электрического удара. Развивающийся зародыш культивировали в течение 6 дней в искусственной химической среде или яйцеводе овцы, перетянутом лигатурой ближе к рогу матки. На стадии морулы или бластоцисты эмбрионы (1-3) трансплантировали в матку приемной матери, где они могли развиваться до рождения. Из 236 опытов ус­пех сопутствовал лишь одному, в результате которого и родилась овечка Долли, со­держащая генетический материал взрослой овцы. В 2002 году овечке был поставлен диагноз - ревматический артрит. Вероятно, болезнь суставов - прямое следствие кло­нирования. В 2003 году ветеринарам пришлось усыпить Долли, после того как в ре­зультате ветеринарного осмотра обнаружили признаки прогрессирующего легочного заболевания.

Следует отметить, что еще в 1962 году Дж. Гёрдон в опытах с южноафрикански­ми жабами в качестве доноров использовал ядра специализированных клеток эпителия кишечника плавающего головастика, а не зародышевые клетки. Ядра яйцеклеток реци­пиентов разрушали ультрафиолетовыми лучами. В большинстве случаев реконструи­рованные яйцеклетки не развивались, но примерно 10% из них образовывала эмбрионы, 6,5% из этих эмбрионов достигали стадии бластулы, 2,5% - стадии головастика, и только 1% развился в половозрелых особей. Однако появление нескольких взрослых особей в таких условиях могло быть связано с тем, что среди клеток эпителия кишеч­ника развивающегося головастика довольно длительное время присутствуют первичные половые клетки, ядра которых могли быть использованы для пересадки.

После рождения Долли путем клонирования появилось много животных, пред­ставляющих несколько групп млекопитающих. Так. в частности, были успешно кло­нированы свиньи, кошки, собаки, овцы, грызуны и мул.

Клонированный в 2003 году мул - Самоцвет Айдахо привлек к себе особое внимание, поскольку мул (помесь лошади и осла) в нормальных условиях не может иметь потомства. Мулы появляются в результате скрещивания самца осла с самкой лошади. Ослы имеют 62 хромосомы, лошади - 64 хромосомы, а мулы, соответствен­но, 63 хромосомы. У самцов мулов сперматогенез блокируется на стадии второго де­ления созревания сперматозоидов. Очень редко потомство дают самки мулов. Мули­цы плодовиты, когда в оогенезе все хромосомы лошади попадают в одну яйцеклетку и мулица скрещивается с жеребцом. При клонировании мула в качестве реципиента использовали яйцеклетки лошади. Успеха удалось достичь только после того, как бы­ла подобрана оптимальная концентрация ионов кальция в среде, где росли яйцеклет­ки, которые использовались для клонированных эмбрионов. В первой серии опытов при переносе 84 гибридных яйцеклеток было получено пять явных беременностей. Во втором серии после I 13 попыток получили 14 беременностей. Восемь из них длились не менее 40 дней, то есть до той стадии, когда прослушивается сердцебиение. В ре­зультате 4 мая родился Самоцвет Айдахо, первый клон гибрида.

Примечательно, что клонирование не всегда приводит к внешнему сходству. Так обстояло дело с клонированной в 2001 году домашней кошкой по кличке Си-Си. Она отличалась своим окрасом от генетического донора. За окрас кошки отвечают несколько генов, присутствующих в Х-хромосоме, и некоторые из них произвольно теряют активность в ходе развития зародыша кошек самок, поскольку у них две X-хромосомы. Таким образом, некоторые клетки, полученные даже у одного и того же донора, будут «окрашивать» кошку в черный цвет при подавлении других цветообра-зующих генов, тогда как другие клетки дадут рыжий окрас. В сентябре 2006 года первая клонированая кошка окотилась. У нее родились трое котят. Котята произошли на свет абсолютно естественным путем, не имеющим отношения к клонированию. Один из котят - серый, он похож на самца. Двое других сохранили пятнистый, черно-белый окрас самки.

Клонировать же собак долгое время не удавалось вообще. Однако в 2005 году, в лаборатории Сеульского национального университета в ЮжнойКорее, на свет появи­лась первая клонированная собака. Кобель Снуппи родился в результате кесарева се­чения 24 апреля. Его выносила суррогатная мать - самка желтого Лабрадора. При ро­ждении щенок весил 530 г. У Снуппи был брат-близнец, еще один щенок, родивший­ся от другой самки. При рождении он весил 550 г, однако спустя 22 дня умер от пневмонии. Каких-либо анатомических отклонений у погибшего щенка при вскрытии обнаружено не было. Чтобы родились эти два щенка, ученым пришлось ввести 1095 эмбрионов 123-м суррогатным самкам. Таким образом, эффективность эксперимента составила 1,6%. Оба щенка были созданы из взрослой клетки кожи, взятой у кобеля афганской гончей при помощи методики ядерного переноса из соматических клеток. Цель данного эксперимента состояла в создании животных для научных исследова­ний, а не в воспроизведении домашних любимцев. Клонирование собаки должно по­мочь лучше изучить болезни, которым подвержены как сами животные, так и люди, на­пример, рак и диабет. Методики на основе стволовых клеток могут быть испытаны сначала на собаках, а затем использованы для лечения человека.

Первое в сельском хозяйстве клонирование взрослых свиней успешно осуще­ствили в штате Висконсин. Клопы были получены из клеток двух взрослых самцов. Два самца были клонированы из-за их высокой генетической ценности. Один из них признан чемпионом графства Йоркшир на выставке-ярмарке 2000 года в штате Ин­диана, да и второй самец не уступает ему по своим качествам. Ученые произвели три переноса ядер из линии клеток, полученных от первого самца, что в результате при­вело к одной удачной беременности. Однако и при клонировании свиней отмечают значительное различие клонов в поведенческом плане. Свинья-клоп по кличке Обжо­ра, полученная в лаборатории Великобритании, отличалась отменным аппетитом и высокой подвижностью, тогда как се клонированная сестра Привереда была весьма избирательна в пищевом отношении и брыкалась, когда ее брали на руки. Кроме то­го, у клонов наблюдались значительные различия в густоте шерсти. В Китайском сельскохозяйственном университете так же успешно клонировали свинью. Поросе­нок, родившийся в китайской провинции Хэбэй. был здоров и весил 1,1 килограмма. Китай стал седьмой страной, успешно клонировавшей свинью, после Великобрита­нии, Японии. США, Австралии, Южной Кореи и Германии.

В 2004 году в университете в Коннектикуте удалось создать генетическую ко­пию ранее клонированного быка. Животное назвали Камитакафуку, ему уже четыре года, и у него пока не обнаружено никаких заболеваний. Первые опыты по клониро­ванию черного японского племенного быка начались еще 17 лет назад. Следуя мето­ду, использованному при клонировании овечки Долли, у быка были взяты образцы кле­ток, и их ядра поместили в яйцеклетки коров. Из полученных таким образом эмбрио­нов выросли четыре теленка, так называемое поколение G1. Тем же самым способом ученые создали из их клеток еще двух животных, поколениеG2. Один теленок умер вскоре после рождения от анемии, однако второй был абсолютно здоров. С помощью клеток его спермы было проведено несколько искусственных оплодотворений, в ре­зультате которых на свет появились еще шесть здоровых телят. Однако попытка соз­дания поколения G3 из клеток животного 02 сорвалась. Причины этой неудачи пока неизвестны.

В 2007 году в Орегонском национальном центре исследования приматов в группе Шухрата Миталипова удалось создать жизнеспособные клонированные эм­брионы из тканей взрослого примата - 10-летнего самца макаки-резус. Однако им­плантация около 100 клонированных эмбрионов в матки 50 суррогатных матерей -самок макаки-резуса не привела к рождению клонированного потомства. Тем не менее, из тканей некоторых клонированных эмбрионов удалось извлечь стволовые клетки и стимулировать их развитие в лабораторных услб'виях. В результате стволовые клетки превратились во взрослые клетки сердца и нейроны мозга.

Летом 2002 года экспедиция Института прикладной экологии Севера в Якутске, новосибирского ГНИ вирусологии и биотехнологии «Вектор», а также японских уче­ных из нескольких научно-исследовательских центров извлекла из мерзлого грунта в Якутии две ноги мамонта с мышцами и кожей, покрытые рыжей шерстью. В подкож­ной клетчатке был обнаружен слой хорошо сохранившихся клеток, имевших целое, неповрежденное ядро. Существует проект использования найденных клеток для по­пытки клонирования мамонта. Вынашивать предполагаемый мамонтовый клон пред­стоит предположительно самке индийского слона.

Ещё более фантастические планы заключаются в клонировании динозавра. Ос­нованием явилось обнаружение фрагментов кровеносных сосудов и клеток в костях тираннозавра. Хотя скелет животного и фрагмент кровеносных сосудов отлично со­хранились, вероятность извлечения из них ДНК, и, тем более, «воскрешения» древнего шеститонного животного вряд ли можно посчитать отличной от нуля.

С этой же целью воссоздания исчезнувшего вида под руководством профессора Университета Нового Южного Уэльса М. Лрчера реанимирован проект клонирования тилацина (он же «сумчатый волк», или «тасманский тигр») - сумчатого млекопитаю­щего, полностью истребленного человеком. Последний сумчатый волк был пойман в 1933 году и умер в зоопарке через 3 года. Первый такой проект, осуществлявшийся в период с 1999 по 2002 год под эгидой Национального Австралийского музея в Сиднее, директором которого тогда был М Арчер, завершилось провалом. При второй по­пытке предполагается получить генетический материал для клонирования тилацина из тела детеныша этого животного, заспиртованоого почти полтора века назад. Об­разцы ДНК должны взять из его зубов и костной ткани.

Внедрение в практику методов межвидового переноса ядер может открыть оп­ределённые перспективы для спасения находящихся на грани исчезновения видов животных. Первым полностью успешным опытом но спасению исчезающего вида следует считать клонирование в 2001 году муфлона - редкого дикого барана, оби­тающего на территории Корсики, Сардинии и Кипра. В эксперименте итальянских ученых домашняя овца благополучно родила ягненка муфлона, который до сих пор жив. Интересно, что в этом случае для клонирования использовали клетки мертвых животных, правда, не многовековой давности.

В конце 2000 - начале 2001 г. американская фирма "ACT" пыталась клониро­вать вымирающий вид буйволов Bosgaurus (гаур), который когда-то был широко рас­пространен на территории Индии и Юго-Западной Азии. Соматические клетки-доноры ядер (кожные фибробласты) были получены в результате биопсии postmortem от быка в возрасте 5 лет и после двух пассажей в культуре длительное время (8 лет) хранились в криоконсервированном состоянии в жидком азоте. Всего было получено четыре беременности. В роли суррогатной матери выступила корова. Что­бы подтвердить генетическое происхождение плодов, два из них были выборочно изъяты. Цитогенетический анализ подтвердил наличие в клетках характерного для гауров нормального кариотипа, однако выяснилось, что вся митохондриальная ДНК происходит от яйцеклеток коров-доноров другого вида (Bostaurus). К сожалению, одна из беременностей прервалась на 200-дневном сроке, а в результате другой ро­дился теленок, который умер спустя 48 часов. Это произошло по причине инфекци­онного клостридиозного энтерита, не имеющего отношения к клонированию.

Еще одно достижение, играющее важную роль в сохранении вымирающих ви­дов животных - появление на свет котят от клонированных диких котов в 2005 году. Котята родились у двух африканских диких кошек (Felislibyca), но у них один отец. 26 июля кошка по кличке Мадж принесла пятерых малышей, в 2 августа на свет ноя-вились еще трое котят, их мать - дикая кошка Кэти. И Мадж, и Кэти в свое время бы­ли клонированы от дикой кошки Нэнси. Отец многочисленного потомства - кот Дигто - является клоном кота по кличке Джаз. Работа с африканскими дикими козами ве­дется почти десять лет. В 1999 году в результате искусственного оплодотворения появились первые котята, а в 2003 году - первые клонированные животные. Felislibyca по размерам немного превосходят обычных домашних кошек, но по расцветке почти не отличаются - те же темные полоски на сером фоне. Исчезновение пока им не грозит, но они являются полезным моделями для разработки методов, которые в не­далеком будущем позволят сохранять редкие виды животных.

В этом же 2005 году завершился эксперимент по клонированию еще одного ис­чезающего вида - монгольской газели. Работы проводились в Китае биотехнологами из провинции Шаньдун. 26 коз вынашивали клонированных эмбрионов. В результате на свет появились шесть детенышей монгольской газели. Два из них родились мерт­выми.

В 2007 году Малайзия начала рассматривает проект по клонированию кожи­стых черепах - древнего вида, который находится под угрозой вымирания. Однако су­ществуют сомнения в практичности и успешности проекта. Во-первых, рептилий еще никто не клонировал, а во-вторых, средства, предназначенные для проекта, можно пустить на природоохранные мероприятия, что может принести гораздо большую пользу.

В целом, анализируя имеющийся материал, можно заключить, что клонирование позвоночных является одной из развивающихся областей современной биотехноло­гии. Практические результаты, к которым должно привести это развитие, включают тиражирование наиболее ценных в сельскохозяйственном отношении генотипов жи­вотных: получение клонированных животных для медицинских целей, сохранение исчезающих биологических видов и, возможно, воссоздание уже исчезнувших.

Обзор написан по сообщениям электронных средств массовой информации.

Адрес публикации: https://www.prodlenka.org/metodicheskie-razrabotki/4168-sovremennye-dostizhenija-klonirovanija-zhivot